Achtergrond qPCR

Met de qPCR analysetechniek worden micro-organismen gedetecteerd en gekwantificeerd op basis van unieke eigenschappen op hun genetisch materiaal (DNA). De kans is groot dat u zelf nooit een qPCR analyse heeft uitgevoerd. Daarom geven we hieronder kort weer wat er bij komt kijken. Ook delen we graag met u welke controles we uitvoeren om de kwaliteit van onze analyses te garanderen.

Stap 1: qPCR analyse ontwikkelen
Stap 2: Bemonstering en conservering
Stap 3: DNA extractie
Stap 4: Inzetten van de analyses
Stap 5: Uitvoer van de analyses

Stap 1: qPCR analyse ontwikkelen

Voordat u een analyse kunt bestellen moeten wij die eerst ontwerpen. Orvion heeft eigen primerdesignsoftware ontwikkeld om dit te kunnen doen voor bacteriesoorten, bacteriegroepen en/of bacteriële omzettingen (specifieke enzymen).

Nadat we een analyse hebben ontworpen wordt deze in ons laboratorium getest, geoptimaliseerd en gevalideerd. Validatie houdt in dat de analyse wordt uitgevoerd op verschillende monsters: één monster waarvan wordt verwacht dat de bacterie er niet in zit, één monsters waarvan we zeker weten dat de bacterie er in zit en één praktijkmonster zoals onze klanten die zullen leveren (grondwater van een saneringslocatie). Ook wordt de analyse door een extern geaccrediteerd laboratorium geverifieerd: komt de gevonden bacteriesoort overeen met de bacteriesoort waarvoor de analyse is ontworpen (dit wordt gedaan met DNA sequencing).

Stap 2: Bemonstering en conservering

Wanneer u een ORVIdetect analyse via onze website heeft besteld sturen wij u bemonsteringsmateriaal toe waarmee u zelf de grondwatermonsters kunt (laten) nemen. Onze bemonsteringspotjes bevatten een conserveringsmiddel waarmee alle bacteriën direct worden doodgemaakt. Dit is gewenst omdat de ORVIdetect analyse het DNA analyseert. We zijn dus niet meer afhankelijk van het ‘in leven houden’ van de bacteriën. Dit is een groot voordeel aangezien u de monsters niet langer gekoeld en binnen korte termijn terug hoeft te sturen, maar gewoon per reguliere post kunt retourneren zonder dat dit een effect heeft op het analyseresultaat! Na aankomst bij Orvion worden uw monsters visueel beoordeeld en in onze database geregistreerd.

Stap 3: DNA extractie

Eenmaal bij Orvion aangekomen wordt al het DNA gezuiverd uit de aanwezige bacteriën in uw grondwatermonsters. Hiertoe worden eerst alle bacteriën kapotgemaakt zodat het DNA (en al het andere celmateriaal) vrijkomt. Dan worden stapsgewijs de ongewenste stoffen verwijderd totdat alleen het DNA overblijft. Globaal geldt voor complexere monsters (grondwater met veel sediment) dat de efficiëntie van de DNA extractie lager is, dit kan betekenen dat dergelijke monsters een hogere detectielimiet hebben.

Het DNA dat we uit uw grondwatermonsters hebben gezuiverd bewaren we in de vriezer. Omdat we voor de analyse slechts een kleine hoeveelheid DNA gebruiken kan uw monster op een later tijdstip opnieuw op andere bacteriën worden geanalyseerd tegen een gereduceerd tarief.

Stap 4: inzetten van de analyses

Nadat het DNA uit uw grondwatermonsters is gezuiverd worden de analyses ingezet. Omdat de qPCR analysemethode zo gevoelig is, is het van belang dat geen externe DNA per ongeluk in de analyse terechtkomt, bijvoorbeeld vanuit gebruikte materialen of van onze eigen huidflora. Hiertoe nemen we de volgende voorzorgsmaatregelen:

· De analyses worden in een speciale UV kast ingezet. Hiermee maken we het aanwezige ‘externe’ DNA kapot met UV licht. Gedurende het inzetten van de analyses wordt de lucht in de kast continue door UV licht behandeld.

· Alle materialen en chemicaliën die we gebruiken zijn gecertifieerd DNA&RNA vrij en worden niet hergebruikt.

· We dragen speciale wegwerphandschoenen en manchetten om contaminatie met onze eigen huidflora te voorkomen.

Stap 5: uitvoer analyse

Wanneer alle reacties zijn ingezet worden deze in het qPCR apparaat geplaatst voor uitvoer van de daadwerkelijk analyse. Orvion beschikt over het nieuwste qPCR apparaat van Roche, de Light Cycler 96, waarmee 96 analyses tegelijkertijd in ongeveer 1 uur worden uitgevoerd. Na afloop beoordelen we eerst de meegenomen kwaliteitscontroles. Indien deze goed zijn worden de kwantitatieve resultaten van uw monsters gegenereerd. Het resultaat wordt weergegeven in aantal cellen per milliliter, waarbij één DNA overeen komt met één bacteriecel. De resultaten worden digitaal aan u gerapporteerd. Uw resultaat: het aantal Dehalococcoides bacteriën per milliliter grondwater.

Kwaliteitscontroles:

DNA extractie controle (DEC): bepaling van de efficiëntie van de DNA zuivering.

Inhibitiecontrole (IHC): controle op ongewenste stoffen die de analyse verstoren. Indien de reactie significant is verstoord voeren we kosteloos een additionele zuiveringsstap uit. Als dit nog onvoldoende blijkt te zijn is uw monster helaas niet geschikt voor dit type analyse.

Positieve controle: Bij uitvoer van elke qPCR analyse nemen we altijd een positieve controle mee om de werking te beoordelen van de gebruikte chemicaliën, analyseprogramma en qPCR apparaat.

IJklijn: ter bepaling van de aantallen in uw monster.

Achtergrondcontrole: We controleren op contaminatie door een analyse mee te nemen waarin geen DNA is toegevoegd (een no template control of NTC), deze moet derhalve altijd een negatief resultaat geven.

Wilt u meer gedetailleerdere informatie over de qPCR analysetechniek dan raden wij de volgende literatuur aan (ook is veel informatie verkrijgbaar op internet):

Bustin, S.A., Benes, V., Garson, J.A., Hellemans, J., Huggett, J., Kubista, M., Mueller, R., Nolan, T., Pfaffl, M.W., Shipley, G.L., et al. (2009). The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clin. Chem. 55, 611–622.

Stephen Bustin (2013). Expert Guides Definitive qPCR: (I) Basic Principles (II) A Practical guide (III) Assay Design (IV) Nucleic Acid Quality Control.

Comments are closed